روش های کلی انتقال ژن به گیاه (روش های ایجاد گیاهان تراریخت) - بخش دوم و پایانی

روش های انتقال ژن در گیاهان شامل موارد زیر می باشند:

1- انتقال غیر مستقیم:

1-1- انتقال ژن از طریق اگروباکتریوم

2- انتقال مستقیم:

2-1- انتقال ژن به روش بمباران ذره ای

2-2 الکتروپوریشن (ایجاد منافذ بوسیله الکتریسیته)

در روش الکتروپوریشن (Electroporation)، برای انتقال DNA، سلولها در معرض ولتاژهای بالا قرار می گیرند. در واقع در اثر شوک الکتریکی، منافذ کوچکی در سطح غشای سلولی بطور موقت ایجاد می شود که به آن خاصیت نفوذپذیری نسبت به اسید نوکلئیک می دهد. در عمل جهت تسهیل عمل جذب، DNA در تماس مستقیم با پروتوپلاست سلول قرار داده می شود. در گیاهان انتقال DNA از طریق الکتروپوریشن در توتون، اطلسی، ذرت، برنج، گندم و سورگوم گزارش شده است. در هویج، توتون و ذرت نیز ژن گزارش گر CAT (کلروم فنیکول استیل ترانسفراز) در ترکیب با راه اندازهای مختلف، از طریق این تکنیک انتقال و ابراز یافته است. این روش قابلیت کاربرد در گونه های مختلف تک لپه و دولپه را دارد.

روش الکتروپوریشن دارای مزایای متعددی است که از آن جمله سرعت و راندمان بالا، سادگی عمل، قابلیت کاربرد در گونه های مختلف گیاهی و سمیت کم برای سلول را می توان ذکر کرد.

در مقابل، نقاط ضعف آن شامل ضرورت استفاده از پروتوپلاست سلولی و مشکلات موجود بر سر راه باززایی و تولید کالوس از آنهاست.

در روش های نوین، استفاده از بافت های با قابلیت باززایی بهتر از قبیل جنین های نارس مدنظر قرار گرفته است.

2-3 ریز تزریق (Microinjection) و درشت تزریق (Macroinjection)

ریز تزریق درون هسته ای یکی از روشهای مستقیم انتقال ژن بوده که بسیاری از مشکلات زیستی و فیزیکی موجود در انتقال DNAرا مرتفع ساخته است. از ریز تزریقی اول بار در سلولهای جانوری استفاده شده است.

در این روش، با استفاده از سوزنهای موئینه مناسب، DNA مورد نظر بدرون سلول میزبان (و یا هسته آن) انتقال یافته به ترتیبی که سلول هدف قابلیت تکثیر و بقاء خود را حفظ می کند.

از مزایای این روش می توان به موارد زیر اشاره کرد:

 1- مقدار DNAتزریق شده مورد استفاده برای هر سلول قابل تنظیم بوده و تحت اثر عوامل تکنیکی دچار محدودیت نمی شود.

2- بدلیل دقت بسیار زیاد در تزریق مستقیم DNA بدرون سلولهای منفرد و قابلیت دسترسی به هسته سلول، شانس بدست آوردن سلول های تراریخت به مراتب افزایش می یابد.

3- با استفاده از این روش، قابلیت انتقال DNAخارجی به درون ساختارهای کوچک(شامل تعداد محدودی سلول) از قبیل جنین های هاپلویید (در مرحله چند سلولی) بدست می آید.

 4- بدلیل انتقال مستقیم ژن، محدودیت نوع میزبان وجود ندارد و در عین حال ضرورت استفاده از سلولهای منفرد در هر تزریق و به کار بستن تجهیزات و مهارت های خاص در این روش محدودیت هایی را بوجود می آورد.

ریز تزریقی دارای کاربردهای ویژه ای در علوم گیاهی می باشد، در مواردی با تزریق مستقیم رنگهای حاوی فلورسنس بدرون سلول های در حال تمایز می توان به نحوه تبادل مواد بین این سلولها پرداخت.

از این روش برای تزریق DNA نوترکیب بدرون سلولهای جنسی حیوانات و یا گیاهان استفاده وسیعی بعمل می آید.

در روش درشت تزریق، با استفاده از  سوزن هایی با قطر بزرگتر از  قطر سلول، DNA خارجی بدرون مجموعه ای از بافت های حاوی جراحات تزریق می شود. بدین ترتیب DNA، برای ترکیب با ژنوم میزبان بایستی از طریق سلول های مجاور مناطق دارای جراحات وارد فضای درون سلولی بشود. در عمل بدلیل وجود موانع مختلف بر سر راه نفوذ DNA، بخصوص در بافت های با دیواره سلولی چند لایه (مانند دانه گرده)، تلفیق DNA خارجی بدرون سلول بسیار مشکل و به ندرت اتفاق می افتد. از این روش معمولا در انتقال سلولهای تخمک و جنین های نارس استفاده می شود.

2-4 تراریختی از طریق لیپوزوم (Lipoinfection)

یکی از تکنیک هایی که در یکی دو دهه اخیر توجه زیادی را بخود جلب کرده است استفاده از لیپوزومها در انتقال ژن می باشد. لیپوزوم ها یک وزیکول غشایی مصنوعی بوده که شامل یک فسفولیپید کروی دو لایه ای می باشند. پس از پوشش یافتن لیپوزومها با اسید نوکلئیک، کمپلکس حاصله که مقاوم به فعالیت نوکلئازها بوده، با قرار گرفتن در مجاورت سلول های میزبان با آنها امتزاج می یابد. استفاده از لیپووزمها به عنوان ناقلین DNA شامل مزایای زیر است:

1- سمیت کم و قابلیت استفاده از گونه های گیاهی متعدد

2- حفاظت اسید نوکلئیک پوشش یافته در سطح لیپوزومها از فعالیت نوکلئازی آنزیم های موجود در محیط کشت

3- راندمان بالا در انتقال DNA بدرون پروتوپلاست سلولهای میزبان

در آزمایشات انجام گرفته بر روی انتقال ویروس موزائیک توتون (Tobacco Mosaic Virus)، از لیپوزمهای فسفاتیدیل سرین دارای بار الکتریکی منفی استفاده شده است.

ناقلین بکار رفته در انتقال ژن از طریق لیپوزومها غالبا از نوع غیر Ti بوده و از این روش عموما برای انتقال میزبان های مقاوم به آگروباکتریوم استفاده بعمل می آید.

معمولا در اثر  Sonicationمخلوطی از فسفاتیدیل سرین در یک بافر آبی، وزیکول های مصنوعی یکنواخت، به قطر 0/4 میکرومتر بدست می آیند.

2-5 انتقال ژن با استفاده از پلی کاتیون ها (Poly- Cation mediated gene transfer)

 یکی از روشهای انتقال DNA، استفاده از پلی کاتیو نهای آبدوست با زنجیره طویل از قبیل پلی اتیلین گلیکول (PEG)، پلی ال لایزین، پلی ال ورنتین و یا DEAE– دکستران می باشد. پلی کاتیون ها خود می توانند شامل یون های فلزی از قبیل کلسیم، سدیم، پتاسیم، روبیدیوم، سزیم، لیتیم و منیزیم باشند. این روش عملا می تواند در انتقال پروتوپلاست های سلولی گونه های مختلف و با استفاده از مقادیر بسیار کم DNA کاربرد داشته باشد. پلی اتیلن گلیکول یک ماده آبدوست قوی بوده که باعث جذب مولکول های آزاد آب در محیط می شود. بنابراین در غلظت های بالای PEG، غلظت های 15الی 25 درصد، مولکول های دارای بار الکتریکی، مانند DNA، قادر به استقرار در حالت محلول نبوده و رسوب می یابند. 

غشاهای سلولی و مولکولهای DNA هر دو دارای بار الکتریکی منفی بوده و این امر موجب کندی جذب DNA از طریق دافعه بارهای هم نام می شود. استفاده از پلی اتیلن گلیکول در غلظت های بالا در واقع دافعه بین این دو سطح را بحداقل رسانده و جذبDNA از طریق غشا سلولی و بدون وارد آمدن صدمات مکانیکی به پروتوپلاست را تسهیل می بخشد. پلی کاتیونها همچنین از طریق حفاظت DNA خارجی در مقابل اثرات تخریبی آنزیمهای نوکلئازی و افزایش خاصیت نفوذ پذیری غشاء سلولی، باعث تسهیل جذب DNA بدرون پروتوپلاست سلولی می شوند.

* در تهیه مطلب حاضر، عمدتا از مطلبی که تحت عنوان: روش های کلی انتقال ژن به گیاه به نویسندگی: دکتر امیر موسوی در درسنامه کارگاه نظری و عملی بیان ژن در گیاهان (اسفند 1379) صفحات 83-71 به چاپ رسیده، استفاده شده است.

روش های کلی انتقال ژن به گیاه (روش های ایجاد گیاهان تراریخت) - بخش اول

روش های کلی انتقال ژن به گیاه (روش های ایجاد گیاهان تراریخت) - بخش اول

انتقال صفات با ارزش به گیاهان زراعی از گذشته های دور با استفاده از روشهای کلاسیک (عمدتا دورگ گیری)، صورت می گرفت. در این روشها محدودیت منبع ژن، بازدارنده اصلی توفیق در برنامه های اصلاحی است. مفهوم این عبارت این است که برای انتقال یک ژن با ارزش باید آن ژن در منبع ژن آن گونه خاص ویا حداکثر گونه های نزدیک قابل تلاقی با گونه مدنظر موجود باشد. در صورتی که این صفت در گونه ای دور از خانواده یا راسته ای متفاوت یافت شود اصلاح نباتات سنتی نمی تواند کاری از پیش ببرد. مهندسی ژنتیک و روش های مختلف انتقال ژن، امکان انتقال ژنهای مورد نظر را از هر موجودی به موجود دیگر فراهم کرده است. روش های انتقال ژن در گیاهان شامل موارد زیر می باشند:

1- انتقال غیر مستقیم:

1-1- انتقال ژن از طریق اگروباکتریوم

2- انتقال مستقیم:

2-1- انتقال ژن بروش بمباران ذره ای

2-2- الکتروپوریشن

2-3- ریز تزریقی و درشت تزریقی

2-4- تراریختی از طریق لیپوزوم

2-5- انتقال ژن با استفاده از پلی کاتیون ها

1- انتقال غیر مستقیم

1-1- انتقال ژن از طریق آگروباکتریوم

در سال 1907 گزارش Smith و Townsendمبتنی بر این که عامل ایجاد بیماری گال طوقه (Crown Gall) یک باکتری گرم منفی هوازی و میله ای شکل به نام آگروباکتریوم تومفاسینس (Agrobacterium tumefaciens) است، انتشار یافت. این پاتوژن بطور عمده از طریق زخمهای ایجاد شده بر روی اندامهای زیر زمینی و طوقه، وارد گیاه شده و از طریق القای رشد بی رویه در سلولهای این منطقه ایجاد بیماری گال طوقه می نماید. بعدها در سال 1974 مطالعات Zaenen و همکارانش نشان داد که ژنهای موجود بر روی یک قطعه DNA خارج کروموزومی باکتری بطول بیش ازKbp ع200 عامل ایجاد آلودگی در گیاه می باشد. این قطعه در واقع شامل پلاسمیدی بود که در سال 1975 توسط Van Larebecke و همکاران بعنوان پلاسمید القاء کننده تومور(Tumor inducing Plasmid) یا پلاسمید Ti نام گرفت. از این زمان باکتری آگروباکتریوم بخاطر قابلیت انتقال قطعه ای از پلاسمید خود به نام انتقالی (Transfer DNA) یا T-DNA به درون سلول میزبان و ابراز طبیعی آن به همراه ژن های میزبان مورد توجه ویژه ای قرار گرفت. طول قطعات T-DNA بسته به اینکه از چه سویه هایی از باکتری منشا گرفته باشند از 12 تا 24 کیلو جفت باز متغیر است. T-DNA دارای دو گروه از ژنها می باشد، گروه اول که به نام ژنهای انکوژن شناخته می شوند، قادر به تولید آنزیمهایی هستند که در ساخت سیتوکینین و اکسین دخالت داشته و عملا تولید تومور می کنند. گروه دوم ژنهایی هستند که مواد خاصی به نام اپاین می سازند که توسط باکتری بعنوان منبع کربن و نیتروژن مورد استفاده قرار می گیرند. تقسیم بندی پلاسمید  Tiبر مبنای اپاین هایی است که تولید می نماید و بر همین مبنا، پلاسمیدهای نوپالینی، اکتوپینی، اگروپینی و مانوپینی شناسایی شده اند.

سویه هایی از باکتری آگروباکتریوم که فاقد پلاسمید Tiمی باشند دارای خاصیت گال زایی در گیاه نمی باشند.

اولین مرحله در انتقال T-DNA به گیاه، جذب باکتری بروی زخم های موجود بر روی سلولهای ناحیه ابتدایی ساقه و طوقه گیاه می باشد. در واقع تصور می شود که زخم های ایجاد شده موانع فیزیکی موجود بر سر راه انتقال باکتری بدرون گیاه را مرتفع ساخته و از این طریق انتقال  T-DNA را تسهیل می بخشند.

امروزه ثابت شده است که عکس العمل باکتری ها غالبا در اثر وجود بعضی از مواد فنولیک همانند Acetosyringone و Hydroxyacetosyringone در محیط است که از بافت های مجروح ترشح می شوند. این مواد در حقیقت قسمتی از محصولات متابولیسم فنیل پروپانویید در گیاه به شمار می آیند که چرخه اصلی ساخت متابولیت های ثانویه از قبیل لیگنین و فلاونوئیدها را شامل می شود. ترکیبات فنولیک مذکور در واقع بعنوان محرک فعالیت برخی از ژنهای موجود بر روی پلاسمید Tiعمل کرده که نقش مهمی را در مراحل انتقال T-DNA به گیاه برعهده دارند. این گروه از ژنها به نام ژنهای بیماریزا (Virulence Genes) و یا ژنهای Vir نامیده می شوند. ژنهای بیماری زا، بر روی ناحیه ای از پلاسمید Ti بطول 35 کیلو جفت باز استقرار یافته اند. محصولات ژنهای بیماریزا برای انتقال و جایگزینی قطعه T-DNA بدرون ژنوم گیاه ضروری هستند. لازم به ذکر است که جهت القای خاصیت تراریختی، قطعه T-DNA و ژنهای بیماری زا ملزم به استقرار بر روی یک پلاسمیدTi  واحد نمی باشند. این بدان معنی است که اگر یک باکتری حاوی پلاسمید و ژنهای بیماری زا و باکتری دیگر حاوی قطعه T-DNA و ژن مورد نظر باشد، قادر خواهند بود فرآیند انتقال T-DNA را بدرون ژنوم گیاه با موفقیت به ثمر برسانند(ناقل های دوگانه).

اولین مورد تراریختی گیاهان توسط Herrera-Estrella در سال 1983 در گیاه تنباکو گزارش گردید. اگرچه آگروباکتریوم بطور طبیعی تنها گیاهان دولپه را آلوده می سازد، اما با درک عمیق مکانیسم انتقال ژن به گیاهان، انتقال ژن به گیاهان تک لپه با استفاده از اگروباکتریوم نیزمیسر گردید، در حال حاضر برنج، موز، گندم، ذرت و نیشکر از گیاهان تک لپه بخوبی تراریخت و باززائی می شوند.

مزایا و معایب روش آگروباکتریوم- مزایا: جوابدهی بسیار بالا برای گیاهان دولپه و بخصوص خانوده سولاناسه، انتقال با کیفیت بالا، تعداد پایین کپی نامبر ژن (تعداد زیاد کپی نامبر ژن، سبب تداخل اثر ژنها می گردد)، دست نخوردگی قطعات ژن (عدم شکستگی، موتاسون کمتر). معایب: بسیار وابسته به کشت این ویترو است و برای هر گونه گیاهی باید از متود ویژه ای برای کشت این ویترو استفاده کرد. ژنوتیپها تحت تاثیر تغییرات سوماکلونال می باشند.

مطالعه پستهای 1 و 2 جهت آشنایی بیشتر با ساختار ژنومی آگروباکتریوم وچگونگی انتقال ژن از طریق آن توصیه می شود.

2- انتقال مستقیم:

توسعه و تکامل ناقلین ژنی در گیاهان غالبا بر اساس انتقال DNA از طریق میزبانهای واسطه باکتریایی صورت گرفته است. در مواردی که انتقال DNAخارجی از این طریق امکان پذیر نیست، روشهای انتقال مستقیم، بر اساس نوع هدف و خصوصیات بافت مورد نظر بکار برده می شوند. در واقع تراریختی مستقیم روشی است که در آن سلولهای میزبان بدون کمک میزبان واسطه DNA خارجی را دریافت می کنند.

دانشمندان علم بیولوژی مولکولی گیاهی امروزه در فکر بکار بستن روشهای نوین در انتقال ژن به غلات هستند. غلات، بعنوان عمده ترین محصولات زراعی، حساسیت کمتری نسبت به آلودگی از طریق آگروباکتریوم و انتقال DNA از خود نشان می دهند و بنابراین محققین عمدتا از روش بمباران ذره ای برای انتقال ژن به خانواده گرامینه استفاده می کنند.

در تراریختی مستقیم، DNA خارجی از طریق تکنیک های مختلف فیزیکی بدرون پروتوپلاست سلولی انتقال می یابد. در ادامه به شرح مختصری در مورد روشهای متداول انتقال مستقیم ژن می پردازیم.

2-1- انتقال ژن بروش بمباران ذره ای

انتقال ژن بروش بمباران ذره ای اولین بار توسط Sanford و همکاران در سال 1987 گزارش شد که در منابع مختلف به نامهای تفنگ ژنی و روش زیست پرتابی نیز مورد اشاره قرار گرفته است. در این روش اسید نوکلئیک بر روی ذراتی از جنس تنگستن و یا طلا به قطر 5 تا نیم میکرون قرار داده شده و با سرعت زیاد (معادل سیصد تا ششصد متر بر ثانیه) توسط گاز هلیوم بداخل بافت های سالم فرستاده می شود.

ذرات ناقل ((Microcarriers پس از قرار گرفتن بر روی یک غشا ناقل (Macrocarriers) با فشار در داخل محفظه تفنگ ژنی پرتاب شده و پس از برخورد با صفحه ای به نام صفحه متوقف کننده (از جنس یک توری فلزی)، بداخل بافت مورد نظر نفوذ می یابند. در چنین شرایطی این ذرات قابلیت نفوذ بدرون غشا سلولی بدون آسیب رساندن به آن را دارا می باشند.

انتقال ژن از طریق بمباران ذره ای یکی از مناسب ترین روشهای انتقال مستقیم DNA در سولهای گیاهی، جانوری، باکتریایی و نیز در سطح اندامک های سلولی می باشد.

عوامل موثر در انتقال  DNAبروش بمباران ذره ای را می توان در سه گروه خصوصیات مربوط به ذرات حامل، شتاب دهنده (Particle accelerator) و نمونه مورد آزمایش خلاصه نمود. عوامل مربوط به ذرات حامل شامل اندازه، مقدار و نوع ذرات حامل و در مورد شتاب دهنده شامل فشار گاز بکاررفته، فاصله مابین غشاحامل و صفحه پاره شونده (Rupture Disk)، فاصله بین غشا حامل و صفحه متوقف کننده (مسافت سیر غشا حامل) و در نهایت فاصله مابین نمونه با صفحه متوقف کننده (مسافت هدف) می باشد.

در این روش با افزایش غلظت DNA تا حد معینی می توان فراوانی سلولهای تراریخت را افزایش داد. از آنجایی که سلولهای انتقال یافته بطور موقت و ناپایدار باعث بیان ژن خارجی می شوند، از این روش در مطالعات مربوط به ابراز ناپایدار ژن Transient gene expressionاستفاده می شود.

در واقع مادامی که DNAخارجی با ژنوم تلفیق نیافته است، تقسیم سلول های تراریخت موجب حذف تدریجی آن می شود، ولی اگرDNA وارد شده به هسته برسد و وارد ژنوم شود، تراریختی پایدار خواهیم داشت.

ساختار و نوع DNA ناقل نیز در تلفیق و تظاهر ژنهای خارجی در درون میزبان بسیار موثر می باشند. بعنوان مثال راندمان تراریختی در حالتی که DNA بکار رفته از نوع خطی می باشد، به مراتب بیش از DNA حلقوی می باشد و همچنین ناقلین پلاسمیدی بزرگ (بیش از 10 کیلو باز) در مقایسه با ناقلین کوچکتر معمولا از میزان ابراز ژن کمتری بدلیل قطعه قطعه شدن DNA در هنگام بمباران ذره ای برخوردارند، به همین دلیل ناقلین مورد استفاده در روش انتقال از طریق آگروباکتریوم معمولا در این روش کاربرد نداشته و از ناقلین با ساختار بهینه سازی شده استفاده می شود. بعنوان مثال پلاسمید  pBI221در واقع شامل بسته ژنی 35S-GUS- Nos از پلاسمید pBI121 بوده که جهت انتقال مستقیم، در پلاسمید pUC19 کلون شده است.

مزایا و معایب روش بمباران ذره ای- مزایا: جوابدهی بسیار بالایی دارد، مثلا در آفتابگردان بدلیل سختی انتقال ژن، فقط روش بمباران ذره ای موثربوده است. معایب: وابستگی به کشت این ویترو، امکان دست خوردگی قطعات ژنی، پایین بودن دقت کار (ممکن است ژن وارد هسته نشود ویا حتی از سلول گیاه عبور کند).

پروتکل انجام بمباران ذره ای در برنج بطور خلاصه بدین شرح است: ذرات طلا با استفاده از پلاسمید حامل ژن بتا گلوکورونیداز (GUS)، توالی ژنی هدف و ژن مقاومت به هیگرومایسین ب پوشش داده می شوند. کالوس های جنین زای برنج با استفاده از این ذرات بوسیله یک دستگاه تفنگ ژنی بمباران می شوند و پس از یک تا 2 روز، فعالیت ژن بتاگلوکورونیداز با استفاده از رنگ آمیزی بافت کالوس به کمک سوبسترایی که در حضور آنزیم حاصل از فعالیت این ژن ایجاد رنگ آبی می کند (سوبسترای 5- برومو 4- کلرو 3- ایندولیل بتا دی گلوکورونید)، مورد مطالعه قرار می گیرد. گروه 5- برومو 4- کلرو 3- ایندولیل در اثر هیدرولیز توسط آنزیم و مولکول اکسیژن، دایمری را تشکیل می دهد که همان رسوب آبی رنگ می باشد که بصورت نقاط یا لکه هایی در کالوسها قابل مشاهده می باشند. کالوس های تراریخته (دارای لکه های آبی رنگ) را به محیط کشت مخصوص القای کالوس (حاوی هیگرومایسین ب) منتقل می کرده و بمدت 15 روز در اتاق تاریک قرار می دهند. کالوس هایی که در این محیط کشت زنده مانده و رشد فعالی نشان می دهند (در این آزمایش، از ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هیگرومایسین بعنوان ژن نشانگر استفاده شده است) را به محیط کشت مخصوص باززایی منتقل کرده و در اتاق روشن قرار می دهند. هر دو هفته یکبار کالوسها را به محیط کشت تازه مخصوص باززایی منتقل می نمایند تا تولید گیاهچه نمایند. پس از رشد گیاهچه ها، باید آنها را به محیط کشت مخصوص ریشه زایی منتقل و پس از ریشه زایی، گیاهچه ها را به محیط کشت مایع یوشیدا منتقل می کنند. پس از 10 تا 15 روز گیاهچه ها را درگلدانهای حاوی خاک به گلخانه می برند. پس از این مرحله، جهت اطمینان از قرار گرفتن ژن در محل هدف ژنوم گیاه میزبان و بیان مناسب و مطلوب آن (تعداد کپی نامبرهای انتقال یافته از ژن هدف)، آنالیزهای مولکولی لازمه چون ساترن، وسترن و الایزا و غیره انجام خواهد گرفت.

آگروباکتریوم و کاربرد آن درانتقال ژن (بخش دوم و پایانی)

انتقال T-DNA و الحاق آن

مكانیزم دقیق انتقالT-DNA نامشخص است. این مكانیزم به انرژی نیاز دارد و معمولا طی 4-2 ساعت بعد از تماس كامل می شود.

ژنهای گیاهی موثر در الحاق T-DNA

به نظر میرسد كه بسیاری از محصولات ژنهای گیاهی برای انتقال T-DNA به درون ژنوم گیاهی لازم هستند. این محصولات دارای نقش مستقیم در حمایت از الحاقT-DNA نیستند بلكه بیشتر رشد و نگهداری سلول گیاهی را حمایت می كنند.

ژنهایT-DNA و تشكیل تومور

T-DNA  حاصل از اگروباكتریوم دو نوع عملكرد دارد: تولید هورمونهای گیاهی و سنتز اپین. ژنهایT-DNA دارای پروموترها وكدونهایی هستند كه به آنها اجازه میدهد تا بصورت قابل توجهی در سلولهای گیاهی ونه در سلولهای باكتری رونویسی شوند.

دامنه میزبانی

A-tumefaciens  دارای دامنه میزبانی وسیعی در خانواده دو لپه ها بوده و بازدانگان میزبان خوبی برای آن نیستند. به نظر میرسد كه این به علت عدم توانایی در تولید مواد القا كننده فنولی باشد. در موارد دیگرهم ممكن است ناسازگاری با سایر فاكتورهای موجود در گیاه میزبان به صورت بیوشیمیایی بروز كند. در بعضی موارد با استفاده از هم كشتی اگروباكتریوم با بافتهای اختصاصی (به عنوان مثال برگچه های لپه ای در براسیكا) توانسته اند بر این ناسازگاریها غلبه كنند.

در غیاب فعالیت انكوژنها چگونه می توان سلولهایی كه دارای قطعاتی از T-DNA هستند را شناسایی كرد؟

نشانگرهای قابل انتخاب:

تنها به بخش كوچكی از جمعیت سلولهای میزبان انتقال داده می شوند.

باید شرایطی را فراهم آورد تا سلولهایحاوی ژن نشانگرزنده مانده و سلولهایی كه به آنها ژن نشانگر انتقال نیافته، بمیرند یا رشد نكنند(= فشار انتخاب).

اولین عملكردهای نشانگر قابل انتخاب در میكروبیولوژی بود.

ژنهای مقاوم به آنتی بیوتیكها

بعضی آنتی بیوتیكها، مانند kanamycin  و hygromycin مانع رشد باكتریها و سلولهای گیاهی می شوند.

بعضی از ژنهای باكتریایی، پروتئین هایی كد میكنند كه باعث تخریب ساختمان آنتی بیوتیك شده و آنرا غیر فعال می سازد، به عنوان مثال نئومایسین فسفوترانسفرازII (nptII) II

در اختیار داشتن یك آنزیم تخریب كننده آنتی بیوتیك، مزیت انتخاب شوندگی را به سلولهای گیاهی می دهد، یعنی  nptII یك ژن نشانگر قابل انتخاب است.

ژنهای نشانگر قابل انتخاب باید در هسته سلولهای گیاهی به صورت كارایی رونویسی شوند.

از پروموترهای مشهور برای این هدفnos (ژن نوپالین سنتتاز) و CaMV35S (از ویروس موزائیك كلم)هستند.

ژن مورد علاقه(هدف)

هر ژنی كه از قطعه T-DNA  بیان می شود باید:

یك پروموتر و یک ترمیناتور مناسب داشته باشد.

دارای یك توالی مناسب شروع كننده باشد.

دارای كدونهای قابل استفاده گیاهی باشد

ژنهای چند تایی میتوانند به صورت همزمان از یك سازه(كانستركت) بیان شوند.

اما محدودیت هایی وجود دارد كه عبارتند از:

اندازه DNA (بزرگتر = الحاق ناكاراتر) و اندازه ناقل كلن كننده (بزرگتر = كنترل و دستكاری سخت تر)

Explant Co-cultivation

یكی از گسترده ترین روشهایی كه استفاده میشود همكشتی ریز نمونه است: به سادگی ریزنمونه را در محلول كشت اگروباكتریوم كه دارای پلاسمیدTi تغییر یافته است فرو می برند. اجازه داده می شود كه مراحل آلودگی به صورت كامل انجام گیرد. سپس صبر می شود تا باقیمانده اگروباكتریوم توسط آنتی بیوتیكها از بین رفته و از محیط حذف شود.

در این روش به سازگاری بین اگروباكتریوم و گیاه میزبان اطمینان میشود.

انتخاب بافت، pH، دما، سویه اگروباكتریوم و القا كننده خارجی باید برای هر سیستمی بهینه شود.

زمانی كه انتقال ژن بوسیله اگروباكتریوم میسر نباشد(مانند گیاهان تک لپه)، از روش دوم انتقال مستقیم DNA به سلول هدف استفاده میشود:  Ballistic transformation       

سیستمهای جایگزین نشانگرهای انتخابگر

مقاومت به آنتی بیوتیكهایkan, hyg  

مقاومت به علف كش Round-up, Basta, Glean

فسفومانوز ایزومراز (PMI)

مراحل انتقال ژن توسط آگروباكتریوم:

ساخت(construct) 

competent كردن آگروباكتریوم

انتقال DNA به آگروباكتریوم

رشد آگروباكتریوم

هم کشتی (co-cultivation)

از بین بردن باكتری با آنتی بیوتیكهای مشخص

رشد احتمالی گیاهچه ها درمحیطهای انتخابی

وکتورهای دوگانه(Binary Vectors)

در اصلاح نباتات، بدلیل دشوار بودن دست ورزی ژنتیکی پلاسمیدها در درون آگروباکتریوم، از باکتری ای کولای نیز در انتقال ژن استفاده می شود، چرا که بدلیل تعداد بالای کپی های پلاسمید در درون ای کولای، دست ورزی پلاسمیدها سهل تر از آگروباکتریوم خواهد بود. همچنین کشف اینکه نیاز به حضور همزمان ژنهای بیماریزا(vir) و T-DNA در درون یک پلاسمید نیست، پژوهشگران را به استفاده از ناقلهای دوگانه ترغیب کرد. دو نوع پلاسمید خواهیم داشت: 1- پلاسمید خلع سلاح شده (Disarmed Ti plasmid ) که فاقد ژن بیماریزا بوده اما حاوی ژن مورد نظر جهت انتقال و همچنین ژنهای مارکر و دو ناحیه Ori)Origin Replication) برای هر دو نوع باکتری ای کولای و آگروباکتریوم می باشد. 2-پلاسمید کمکی(Helper vector) که حاوی ژنهای بیماریزا بوده و تنها Ori متعلق به آگروباکتریوم را در برگرفته و فاقد توالی T-DNA می باشد.

روال کار: پس از وارد سازی ژن هدف به پلاسمید خلع سلاح شده، این پلاسمید بدرون ای کولای انتقال می یابد و سپس بنابر تظاهر ژنهای مارکر(معمولا مقاوم به آنتی بیوتیک)، باکتریهای حاوی پلاسمید نوترکیب شناسایی شده و در مرحله بعد پلاسمید خلع سلاح شده، از طریق الکتروپوریشن(جریان الکتریسته) یا ایجاد تقاطع(Conjugation) به آگروباکتریوم حاوی پلاسمید کمکی انتقال می یابد. سپس با آلوده سازی بافت کالوس گیاهی حاصل از X-plant توسط آگروباکتریوم حاوی هر دو نوع پلاسمید، امکان انتقال ژن هدف به گیاه فراهم می شود. گفتنی است که ژنهای بیماریزای حاضر در پلاسمید کمکی، پروتئین های لازم جهت انتقال ژن(DNA) هدف بدرون گیاه را فراهم می آورند. در مرحله پایانی گیاهچه های تراریخته مقاوم به آنتی بیوتیک شناسایی و باززایی می شوند تا بتوان گیاه کامل حاوی ژن مورد نظر را بدست آورد.

مراحل انتقال ژن توسط تفنگ ژنی

ساخت constract

انتقال به E. Coli

رشد باكتری

استخراج(پلاسمید) DNA

رسوب دادن DNA بر روی ذرات طلا

تهیه ریز نمونه و استقرار آنها روی محیط

شلیك ذرات طلا و DNA بر روی ریزنمونه آماده شده

آگروباکتریوم و کاربرد آن در انتقال ژن) بخش اول) 

آگروباكتریوم: نوعی باكتری خاكزی گرم منفی است كه باعث بیماری گال تاجی در گیاهان میشود.

A.tumefaciens: آگروباكتریوم توم فاسینس- تشكیل گال طوقه

A. rhizogenes: آگروباكتریوم ریزوژنز- بیماری ریشه های مویی

چگونه آگروباكتریوم باعث بروز بیماری می شود؟

تشابه ظاهری بین گال های تولید شده توسط آگروباكتریوم و تومورهای حیوانات توجه دانشمندان را در سالهای 1960 و 1970 به خود جلب كرد به این طریق كه گال ها به مانند سرطان میمانند؟ در نهایت دانشمندان به این نتیجه رسیدند كه مگاپلاسمید برای بوجود آمدن بیماری ضروری است. مگاپلاسمید آگروباكتریوم تومفاسینس در نهایت به عنوان پلاسمید (القاكننده تومور) تعیین شد. به صورت مشابه مگاپلاسمید آگروباكتریوم ریزوژنز به عنوان پلاسمید  شناخته میشود. در ان زمان این طور فرض شد كه این پلاسمیدها ممكن است به صورت فعال وارد سلولهای میزبان شوند اما فناوری در ان زمان به اندازه كافی پیشرفته نبود تا قطعات كوچك در ژنوم بزرگ گیاه را تشخیص دهد. با بوجود آمدن تکینیک DNA نوترکیب (به عنوان مثال آنزیمهای برشی لكه گزاری یا بلات كردن) امكان اینكه صحت فرضیه انتقال DNA بررسی شود امكان پذیر شد. ثابت شده است كه تشكیل گال بستگی به فعالیت تعداد محدودی از ژنها (آنكوژنها) دارد كه برروی پلاسمید قرار دارند. این ژنها همچنین باعث سنتز تركیبات نیتروژنی غیر معمول (اپین ها) در بافت گال میشوند.

محل و چگونگی بوجود آمدن گال

آگروباكتریوم از محل زخم تازه وارد گیاه میزبان می شود. محل زخم دو اثر مهم در كلن شدن آگروباكتریوم دارد:

1- ترشح متابولیتهای فنولی كه آگروباكتریوم آنرا تشخیص میدهد و با فعال كردن ژنهای لازم برای انتقال DNA عكس العمل نشان میدهد 2- فضایی برای فعالیت تقسیم سلولی بوجود میاورد و در همین حال محل زخم ترمیم میشود.

القاكننده های Vir فنولی محصول متابولیسم فنل پروپانوید هستند به نظر میرسد كه اینها با مولكولهایی كه در استحكام مارپیچ پلی ساكارید دیواره سلولی نقش دارند مرتبط باشند( به عنوان مثال انتقال دهنده های فنلی و لیگنین های پلیمری).

القای Vir همچنین با حضور قندهای ساده و PH اسیدی كه هر دو آنها در اثر بروز زخم در گیاه بوجود میاید تشدید میشود.

آگروباكتریوم باید به صورت فیزیكی به دیواده سلولی متصل شود تا بتواند T-DNA خود را به گیاه انتقال دهد. وقتی تماس اولیه بر قرار شد باكتری ها شبكه در هم پیچیده ای از فیبریل های سلولزی (بتا- 1-4 گلوكان) را بوجود میاورند كه كمك میكند تا سلولها به دیواره سلولهای گیاهی متصل شوند.

جابجایی DNA:

بطورمعمول شامل یك پلاسمید بزرگ به اضافه كروموزمهای آن میباشد. فعالیتهای متفاوت بیولوژیكی آنها توسط ژنهایی كه روی پلاسمید هستند دیكته میشود.

Ti plasmid :

3 منطقه مهم برای جابحایی DNA و تشكیل غده وجود دارد: T-DNA، T-DNA Borders و منطقه Vir.

T-DNA:

دارای ژنهای كد كننده برای بیوسنتز فیتوهورمونها(اكسین و سیتوكینین) و ژنهای كد كننده برای سنتز اپین است که این ژنها فقط در گیاه رونویسی میشوند.

Opin ها قندها و پروتئین های نادری هستند که T-DNA، گیاه را مجبور به ساختن آنها می کند. این مواد بعنوان منبع غذایی از کربن و نیتروژن مورد استفاده باکتری قرار می گیرند. از مهمترین انواع اپاین ها، Nopalin ها و Octopin ها هستند:

nopaline = arginine + alpha-ketoglutarate

octopine = arginine + pyruvate

mannopine = glutamine + mannose

agrocinopine A = sucrose + arabinose

:T-DNA borders

24-25 جفت باز با ترتیب تكراری در هر دو طرف  T-DNAقرار دارند که  به نظر می رسد فقط طرف راست(Right Border) مهم باشد.

Vir region:

یک منطقه 35 كیلو بازی، شامل 6-9 واحد قابل رونویسی .(VirA, B, C, D, E, F, G, H, J)

برای تشكیل گال چهار لوكوس ویر قابل اهمیت است(A, B, D and G) .

بعضی از محصول فعالیت ژنهای ویر در داخل سلول باكتری است ولی بعضی دیگر منتقل میشوند و در داخل سلول میزبان عمل میكنند.

بیشتر ژنهای ویر در غیاب سلولهای میزبان خاموش هستند ولی VirA و VirG به مقدار کم رونویسی می شوند. VirA  و VirG به صورت یك سیستم كنترل كننده سلسله مراتب، بقیه ژنهای ویر را كنترل میكنند.

VirA با غشائ داخلی باكتری متصل گردیده و با ژن كروموزومی ChvE یک کمپلکس تشکیل می دهد. پیوند یك ملكول فنول خاص كه با Vir A كمپلكس تشكیل میدهد باعث فعالیت پروتئین كیناز و فسفریلیزاسیون میشود.

محصولات ژن (VirD1 and VirD2) virD به توالی سمت راست مرزی متصل شده و یك شكاف در انتهای T-DNA بوجود میاورند. این فعالت با محصولات ژن VirC که به توالی های مجاور متصل می شوند تشدید می شود.

پروتئین VirD2 با پیوندهای کووالانسی به انتهای رشته T، در طی مراحل انتقال متصل می ماند.

پروتئین VirE2 یک پروتئین متصل به DNA تک رشته ای است که چندین کپی از آن رشته DNA را احاطه می کنند. VirE2 نیز به میزبان منتقل می شود. محصولات ژن VirB یک ساختار ترشحی نوع 4 را تشکیل میدهد که در هدایت ساختار نقش دارد.

سایر نواحی پلاسمید  Tiنیز نقشهای مهمی ایفا میكنند:

ناحیه اتصال - توانایی اگروباكتریوم را برای تبادل پلاسمیدها با دیگر سلولهای باكتریایی كنترل میكند كه با سیستم انتقال T-DNAمشابه است.

ناحیه كاتابولیسم اپین - پروتئینهایی را كد میكند كه برای وارد كردن و استفاده كردن ازكلاس مشابه اپینهایی كه سنتز آنها بوسیلهT-DNA انجام می شود لازم است.

ناحیه همانند سازی پلاسمید - اجازه می دهد تا آگروباكتریوم پلاسمیدTi  را طی تقسیم سلولی نگه دارد.

آگروباکتریوم و کاربرد آن درانتقال ژن (بخش دوم و پایانی)