اصلاح نباتات | هفته چهارم فروردین ۱۳۹۰

به وبلاگ اصلاح نباتات خوش آمدید. لطفا اگر سوال یا نظری در مورد مطالب طرح شده دارید، از طریق گذاشتن نظر یا ارسال ایمیل مرا از آن مطلع سازید

آگروباکتریوم و کاربرد آن در انتقال ژن (بخش دوم و پایانی)

تاريخ : چهارشنبه سی و یکم فروردین ۱۳۹۰

آگروباکتریوم و کاربرد آن درانتقال ژن (بخش دوم و پایانی)

انتقال T-DNA و الحاق آن

مكانیزم دقیق انتقالT-DNA نامشخص است. این مكانیزم به انرژی نیاز دارد و معمولا طی 4-2 ساعت بعد از تماس كامل می شود.

ژنهای گیاهی موثر در الحاق T-DNA

به نظر میرسد كه بسیاری از محصولات ژنهای گیاهی برای انتقال T-DNA به درون ژنوم گیاهی لازم هستند. این محصولات دارای نقش مستقیم در حمایت از الحاقT-DNA نیستند بلكه بیشتر رشد و نگهداری سلول گیاهی را حمایت می كنند.

ژنهایT-DNA و تشكیل تومور

T-DNA حاصل از اگروباكتریوم دو نوع عملكرد دارد: تولید هورمونهای گیاهی و سنتز اپین. ژنهایT-DNA دارای پروموترها وكدونهایی هستند كه به آنها اجازه میدهد تا بصورت قابل توجهی در سلولهای گیاهی ونه در سلولهای باكتری رونویسی شوند.

دامنه میزبانی

A-tumefaciens دارای دامنه میزبانی وسیعی در خانواده دو لپه ها بوده و بازدانگان میزبان خوبی برای آن نیستند. به نظر میرسد كه این به علت عدم توانایی در تولید مواد القا كننده فنولی باشد. در موارد دیگرهم ممكن است ناسازگاری با سایر فاكتورهای موجود در گیاه میزبان به صورت بیوشیمیایی بروز كند. در بعضی موارد با استفاده از هم كشتی اگروباكتریوم با بافتهای اختصاصی (به عنوان مثال برگچه های لپه ای در براسیكا) توانسته اند بر این ناسازگاریها غلبه كنند.

در غیاب فعالیت انكوژنها چگونه می توان سلولهایی كه دارای قطعاتی از T-DNA هستند را شناسایی كرد؟

نشانگرهای قابل انتخاب:

تنها به بخش كوچكی از جمعیت سلولهای میزبان انتقال داده می شوند.

باید شرایطی را فراهم آورد تا سلولهایحاوی ژن نشانگرزنده مانده و سلولهایی كه به آنها ژن نشانگر انتقال نیافته، بمیرند یا رشد نكنند(= فشار انتخاب).

اولین عملكردهای نشانگر قابل انتخاب در میكروبیولوژی بود.

ژنهای مقاوم به آنتی بیوتیكها

بعضی آنتی بیوتیكها، مانند kanamycin و hygromycin مانع رشد باكتریها و سلولهای گیاهی می شوند.

بعضی از ژنهای باكتریایی، پروتئین هایی كد میكنند كه باعث تخریب ساختمان آنتی بیوتیك شده و آنرا غیر فعال می سازد، به عنوان مثال نئومایسین فسفوترانسفرازII (nptII) II

در اختیار داشتن یك آنزیم تخریب كننده آنتی بیوتیك، مزیت انتخاب شوندگی را به سلولهای گیاهی می دهد، یعنی nptII یك ژن نشانگر قابل انتخاب است.

ژنهای نشانگر قابل انتخاب باید در هسته سلولهای گیاهی به صورت كارایی رونویسی شوند.

از پروموترهای مشهور برای این هدفnos (ژن نوپالین سنتتاز) و CaMV35S (از ویروس موزائیك كلم)هستند.

ژن مورد علاقه(هدف)

هر ژنی كه از قطعه T-DNA بیان می شود باید:

یك پروموتر و یک ترمیناتور مناسب داشته باشد.

دارای یك توالی مناسب شروع كننده باشد.

دارای كدونهای قابل استفاده گیاهی باشد

ژنهای چند تایی میتوانند به صورت همزمان از یك سازه(كانستركت) بیان شوند.

اما محدودیت هایی وجود دارد كه عبارتند از:

اندازه DNA (بزرگتر = الحاق ناكاراتر) و اندازه ناقل كلن كننده (بزرگتر = كنترل و دستكاری سخت تر)

Explant Co-cultivation

یكی از گسترده ترین روشهایی كه استفاده میشود همكشتی ریز نمونه است: به سادگی ریزنمونه را در محلول كشت اگروباكتریوم كه دارای پلاسمیدTi تغییر یافته است فرو می برند. اجازه داده می شود كه مراحل آلودگی به صورت كامل انجام گیرد. سپس صبر می شود تا باقیمانده اگروباكتریوم توسط آنتی بیوتیكها از بین رفته و از محیط حذف شود.

در این روش به سازگاری بین اگروباكتریوم و گیاه میزبان اطمینان میشود.

انتخاب بافت، pH، دما، سویه اگروباكتریوم و القا كننده خارجی باید برای هر سیستمی بهینه شود.

زمانی كه انتقال ژن بوسیله اگروباكتریوم میسر نباشد(مانند گیاهان تک لپه)، از روش دوم انتقال مستقیم DNA به سلول هدف استفاده میشود: Ballistic transformation

سیستمهای جایگزین نشانگرهای انتخابگر

مقاومت به آنتی بیوتیكهایkan, hyg

مقاومت به علف كش Round-up, Basta, Glean

فسفومانوز ایزومراز (PMI)

مراحل انتقال ژن توسط آگروباكتریوم:

ساخت(construct)

competent كردن آگروباكتریوم

انتقال DNA به آگروباكتریوم

رشد آگروباكتریوم

هم کشتی (co-cultivation)

از بین بردن باكتری با آنتی بیوتیكهای مشخص

رشد احتمالی گیاهچه ها درمحیطهای انتخابی

وکتورهای دوگانه(Binary Vectors)

در اصلاح نباتات، بدلیل دشوار بودن دست ورزی ژنتیکی پلاسمیدها در درون آگروباکتریوم، از باکتری ای کولای نیز در انتقال ژن استفاده می شود، چرا که بدلیل تعداد بالای کپی های پلاسمید در درون ای کولای، دست ورزی پلاسمیدها سهل تر از آگروباکتریوم خواهد بود. همچنین کشف اینکه نیاز به حضور همزمان ژنهای بیماریزا(vir) و T-DNA در درون یک پلاسمید نیست، پژوهشگران را به استفاده از ناقلهای دوگانه ترغیب کرد. دو نوع پلاسمید خواهیم داشت: 1- پلاسمید خلع سلاح شده (Disarmed Ti plasmid ) که فاقد ژن بیماریزا بوده اما حاوی ژن مورد نظر جهت انتقال و همچنین ژنهای مارکر و دو ناحیه Ori)Origin Replication) برای هر دو نوع باکتری ای کولای و آگروباکتریوم می باشد. 2-پلاسمید کمکی(Helper vector) که حاوی ژنهای بیماریزا بوده و تنها Ori متعلق به آگروباکتریوم را در برگرفته و فاقد توالی T-DNA می باشد.

روال کار: پس از وارد سازی ژن هدف به پلاسمید خلع سلاح شده، این پلاسمید بدرون ای کولای انتقال می یابد و سپس بنابر تظاهر ژنهای مارکر(معمولا مقاوم به آنتی بیوتیک)، باکتریهای حاوی پلاسمید نوترکیب شناسایی شده و در مرحله بعد پلاسمید خلع سلاح شده، از طریق الکتروپوریشن(جریان الکتریسته) یا ایجاد تقاطع(Conjugation) به آگروباکتریوم حاوی پلاسمید کمکی انتقال می یابد. سپس با آلوده سازی بافت کالوس گیاهی حاصل از X-plant توسط آگروباکتریوم حاوی هر دو نوع پلاسمید، امکان انتقال ژن هدف به گیاه فراهم می شود. گفتنی است که ژنهای بیماریزای حاضر در پلاسمید کمکی، پروتئین های لازم جهت انتقال ژن(DNA) هدف بدرون گیاه را فراهم می آورند. در مرحله پایانی گیاهچه های تراریخته مقاوم به آنتی بیوتیک شناسایی و باززایی می شوند تا بتوان گیاه کامل حاوی ژن مورد نظر را بدست آورد.