تنوع بیولوژیکی

قبل از اجراي يك برنامه دراز مدت اصلاحي، به طور معمول مطالعات ژنتيكي انجام مي­گيرد. اطلاعاتي در مورد مقدار و ماهيت تنوع ژنتيكي و همبستگي بين صفات لازم است تا يك برنامه موثر اصلاحي نظير گزينش يا تلاقي براي اصلاح يك رقم اجرا گردد. تنوع بیولوژیکی به تعداد، گوناگونی و تغییرات گونه­ های گیاهی، جانوری و میکروارگانیسم­ها و سیستم های اکولوژیکی اطلاق می­شود. تنوع بیولوژیکی را می توان در سه سطح تعریف کرد:

- تنوع ژنتیکی که به اختلافات موجود درون یک گونه اطلاق می شود.

- تنوع گونه ­ای که به تنوع و فراوانی گونه ­های مختلف در یک ناحیه اطلاق می شود.

- تنوع اکوسیستمی که به وسیله رستنگاه­های متنوع مانند علف زارها یا باتلاق­هایی که در داخل یک منطقه به وجود می آید توصیف می شود(Jensen et al., 1990 ) .

1- منبع ژنتیکی

واژه منبع ژنتیکی به معنای وسیع کلمه، شامل تنوع ژنتیکی در هر موجود بیولوژیکی است و در مفهوم محدودتر، عبارت از تنوع ژنتیکی موجود در گیاهان زراعی و گونه ­های وحشی وابسته به آنها می­باشد(IBPGR, 1987). انواع منابع تنوع ژنتیکی گیاهی که توفیق برنامه­ های آینده اصلاح نباتات به آن بستگی دارد، عبارتند از: گونه ­های وحشی، ارقام بومی، اشکال ابتدایی گیاهان زراعی در مراکز تنوع اولیه آنها ، گیاهان مهاجر به مراکز ثانویه­ ای که تنوع آنها ممکن است در آنجا زیادتر شده باشد و ارقام زراعی (Creech and Retiz, 1971). براساس تقسم بندی هارلان و دویت (1971) در هر منبع ژنتیکی ، سه دسته مواد ژنتیکی وجود دارد:

الف- منبع ژنی اولیه : شامل گونه­ هایی است که می­توانند هیبریدهای بارور تولید کنند.

ب- منبع ژنی ثانویه: شامل گونه هایی است که واجد ژن­های ­قابل دسترس تر را دارا بوده و هیبریدهایی با باروری محدود ایجاد می کنند.

ج- منبع ژنی ثالثیه : این منبع دارای ژن­هایی است که به راحتی قابل انتقال به گونه­ های زراعی نبوده و در برنامه ­های اصلاح نباتات و دو­رگ گیری فقط در سطح محدود مورد استفاده قرار می­گیرند.

2- عوامل موثر در تنوع ژنتیکی

ترکیب ژنتیکی یک جمعیت گیاهی تحت تاثیر جهش، مهاجرت و نوترکیبی قرار می­گیرد در مقابل، تنوع ژنتیکی به وسیله گزینش مصنوعی و طبیعی و رانده شدگی ژنتیکی کاهش می­یابد. تغییر در فراوانی الل­های مطلوب که سازگاری گیاهان به محیط­های ساخت بشر را افزایش می­دهند، در تکامل گیاهی بسیار مهم بوده و بیانگر تنوع ژنتیکی گیاهی فعلی هستند (Ortiz , 1999). همچنین، مکانیزم­هایی از قبیل گرده افشانی طبیعی، موانع جغرافیایی، سیستم­های اصلاحی خود ناسازگاری، نرعقیمی و تکثیر رویشی، تکامل و اهلی شدن گیاهان را تحت تاثیر قرار داده ­اند.

3- روش­های برآورد تنوع ژنتیکی

در حال حاضر گرایش فزاینده ­ای برای دستیابی به نشانگرهای بیشتر جهت تهیه و ایجاد نقشه کامل ژنتیکی در اکثر گیاهان زراعی وجود دارد. این قبیل نقشه­ ها باعث می­شوند که ژن­های اصلی که شناسایی می­شوند، بسرعت تعیین محل گردند. نشانگرهای به عنوان یک وسیله برای شناسایی قطعات کروموزوم و دنبال کردن آنها در برنامه ­های هیبریداسیون برای انتقال مستقیم ژن­ها به کار می­روند­. نشانگرها همچنین برای شناسایی ژنوتیپ­ها و خلوص ژنتیکی ارقام زراعی مورد استفاده قرار می گیرند. به طور کلی، نشانگرها را می توان به چهار گروه تقسیم نمود (بزرگی، 1373 ):

پلی مرفیسم ISSR و کاربرد آن در اصلاح نباتات (بخش دوم و پایانی)

کاربرد مارکرهایISSR

پتانسیل ادغام ISSR-PCR در برنامه‌های اصلاح نباتات فراوان است (جدول 2). در ادامه حوزه‌های اصلی کاربرد ISSR-PCR در گیاهان مختلف مورد اشاره قرار خواهند گرفت.

انگشت نگاری ژنومی

انگشت نگاریDNA، ابزاری مهم برای خصوصیت یابی ژرم پلاسم و بنیان شناسایی ارقام/هیبریدها/ منابع والدی و غیره در اصلاح نباتات و مدیریت ژرم پلاسم می‌باشد. پرایمرهای ISSR دو نوکلئوتیدی متصل به انتهای 5’ یا 3’، در مطالعات انگشت نگاری با تکرارپذیری بالا برای مدیریت کلکسیون ژنومی کاکائو بکار گرفته شده‌اند. ISSR ها، پلی مرفیسم کافی برای تمایز میان ارقام مختلف گل داوودی را نشان داده‌اند. همچنین، ISSR ها، امکان تمایز بین گیاهان حاصل از میکروسپور و گیاهان حاصل از کشت سوماتیک در کشت پرچم کتان، را در مراحل ابتدایی گیاهچه فراهم کرده‌اند.

تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی

ISSR ها بطور موفقیت آمیزی برای تخمین توسعه تنوع ژنتیکی در سطوح بین و درون گونه‌ای در گستره وسیعی از گونه‌های گیاهی، شامل برنج، گندم، ارزن انگشتی، سیب زمینی شیرین و بارهنگ، بکار گرفته شده‌اند. برتری ISSR-PCR بر دیگر تکنیک‌های مارکری در مطالعات مختلف مشخص شده است. برای مثال، مشخص شده که پرایمرهای SSR اتصالی، مفیدتر و تکرارپذیرتر از ایزوزایم‌ها، RFLPs و RAPDs در آنالیز تنوع ژرم پلاسم پرتقال سه برگی می‌باشند. ISSR ها در آنالیز تنوع در جنسEleusine، از نظر کیفیت و کمیت داده‌های حاصله، نسبت به RFLP و RAPD، مفیدتر بوده‌اند. بطور معنی داری، راندمان تکنیک در توصیف خصوصیات حتی در سطح واریته‌های یک گونه نیز مستدل بود. برای مثال، سه پرایمر متصل به 5’ توانستند 20 رقم Brassica napus را از یکدیگر تمایز دهند. ISSR، مارکر گزینش برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در کاکائو، بازدانگان و حتی قارچ‌هاست. در مطالعه‌ای بر لوپین سفید، مشخص شد که در میان 10 پرایمر مورد استفاده، دو پرایمر برای شناسایی تمامی 37 مجموعه مورد مطالعه، کافی بودند. متشابها، 4 پرایمر برای تمایز 34 رقم سیب زمینی و سه پرایمر برای تمایز 16 ژنوتیپ توت قرمز کافی بودند. استفاده از چنین پرایمرهای مفیدی، هزینه، زمان و کار آنالیز تنوع را کاهش می‌دهد.

تکنیک‌های مارکری مختلف در مطالعات فیلوژنتیک بر پایه شباهت نسبی بکار گرفته شده‌اند. علیرغم راندمان و تکرارپذیری بالاتر مارکرهایISSR، آنها هنوز بطور گسترده استفاده نمی‌شوند. اما کاربرد آنها در حل مشکلات مرتبط به فیلوژنی برنج اهلی آسیایی، گندم، ارزن انگشتی، Vigna و گونه‌های Diplotaxis مفید بوده است. چشم انداز وسیعی از کاربرد این تکنیک قوی برای تعیین روابط بین گونه‌ای در بسیاری از جنس‌ها و تمایز جنس‌های مختلف در درون یک خانواده وجود دارد. بطور قابل توجهی، مارکرهای ISSR اختصاصی ژنوم/گونه‌ها در چهار جنس Oryza، Lolium ، Festuca و Diplotaxis  گزارش شده‌اند که در شناسایی گونه‌ها مفید بوده‌اند.

نقشه یابی ژنوم

انجام نقشه یابی مولکولی و گزینش به کمک مارکر برای بهبود صفات کمی و کیفی گیاهان زراعی (بخش دوم)

2- گندم

گزارشات مختلف در مورد نقشه یابی ژنهای مقاومت به حشرات و بیماریها، تنش های غیر زنده، کیفیت دانه و دیگر صفات در جدول یک فهرست شده اند. زنگ گندم از موضوعات اساسی است که نتایج بسیار موفقیت آمیزی در مورد نقشه یابی ژن آن تاکنون گزارش شده است. یک مارکر جایگاه با توالی نشاندار(STS) پیوسته به Lr28، ژن مقاومت به زنگ برگ، بوسیله آنالیزRAPD لاینهای تقریبا ایزوژن (NILs)، در هشت بک گراند مختلف شناسایی شده است. از 80 پرایمر تست شده، یک مارکر رپید قادر به تفکیک NILs و والد اهدایی از والد دوره ای حساس بود. مقایسات میان NILs و والدین دوره ای شان برای شناسایی مارکرهای مولکولی پیوسته با ژنهای نشانگر مقاومت به پاتوژن ها، مفید بود. توسعه مارکرهای تکرار توالی بین ریزماهواره ای ساده(ISSR primers)، برای ژنهای مقاومت به زنگ ساقه(SR39) و زنگ برگ(Lr 35)، انتقال این ژنها به لاینهای الیت گندم را تسهیل کرده است. مارکرهای ریز ماهواره برای شناسایی پلی مورفیسم DNA در مجموعه های مقاوم به زنگ زرد بکار گرفته شده اند. نه مارکر ریز ماهواره پیوسته با ژن مقاومت به زنگ نواری،YrH52، شناسایی شده اند. مارکرهای ریزماهواره برای برچسب زنی ژنهای مختلف یاQTL، شامل ژنهای Rht8،Rht12 و Vrn1و QGpc.ccsu.2D.1 یک QTL درصد پروتئین دانه، بکار گرفته شده اند. مشکل جوانه زنی پیش از برداشت، بخصوص در دانه های کهربایی، در عمده مناطق رشد گندم در جهان ، از جمله هند، معمول است. بهبود درصد پروتئین دانه و ترکیب آن در گندم نان کاری مشکل و بعنوان دلمشغولی عمده اصلاحگران نبات باقی مانده است. QTL های تحمل به پیش جوانه زنی و درصد پروتئین دانه با استفاده از مارکرهای مکانهای چندگانه با توالی نشاندار (STMS) و مکانهای با توالی نشاندار(STS)، برچسب زنی شده اند.

3- کلزا

Brassica juncea (خردل هندی یا خردل قهوه ای)، B. rapa (شلغم روغنی) و B. napus (کلزا) عمده Brassica های دانه روغنی هستند. در این گروه از محصولات، مارکرهای مولکولی برای نقشه یابی ژنهای بنیادین برای مقاومت به بیماری و کیفیت روغن و خوراک بکار گرفته می شوند. تلاشهای مختلفی برای شناسایی مارکرهای مقاومت به زنگ سفید، حاصل از قارچ Albugo candida، یک بیماری مخرب و با شیوع گسترده در این محصولات که عملکرد را به میزان 60-30 درصد در مزارع بشدت آلوده کاهش می دهد، انجام شده است. یک لوکوس (ACA1)کنترل کننده مقاومت به A. candida در B. napus با استفاده از مارکرهایA. candida نقشه یابی شده است. یک لوکوس منفرد کنترل کننده مقاومت بهAC2 در B. rapa با استفاده از مارکرهای RFLP و یک جمعیت در حال تفرق از تلاقی میان Per (مقاوم به AC2 and AC7) و ‘R500’ (حساس) نقشه یابی شده است. یک مارکر RFLP هم افتراقی (X140a)و دو مارکر RFLP بشدت پیوسته(X42 و X83) که برای MAS و نقشه یابی برپایه کلونینگ ژن منفرد (Acr) مسئول اعطای مقاومت به A. candida در B. juncea، مفید می باشند شناسایی شده اند. نقشه یابی ژن مقاومت (Ac2t) در B. juncea حاصل از یک منبع روسی مقاوم در برابر ایزوله کانادایی بسیار قدرتمند A. candida انجام شده است. مجموعه BEC-144 (B. juncea) حاصل از لهستان، نشان دهنده مقاومت به ایزوله های هندی پاتوژن زنگ سفید بوده است. شناسایی دو مارکر پیوسته در فازهای جفت و ناجفت احاطه کننده ژن کنترل گر مقاومت به A. candida در BEC-144 گزارش شده است. این کار بعدها با توسعه مارکرهای AFLP و CAPS برای این ژن، گسترش بیشتری یافت. علاوه بر این معتبر بودن مارکر CAPS در جمعیت های متفاوت، بیانگر سودمند بودن آن در امرگزینش به کمک مارکر است. نقشه یابی ژنهای مقاومت به زنگ سفید در B. rapa با استفاده از جمعیت های نوترکیب اینبرد و یک نقشه پیوستگی ژنتیکی شامل 144 مارکر RFLP و سه مارکر فنوتیپی انجام شده است. مارکرهای مولکولی ژنهای مقاومت به Leptosphaeria maculans در B. napus ، بوسیله تحقیقات مختلف ایجاد شده اند. لوکوس مقاومت LmFr1 با مارکرهای cDNA 011 و cDNA 110 پیوسته بوده و در درون گروه لینکاژی 6 (LG6) جای گرفته است. لوکوس های pb-3 و pb-4 مقاومت به Plasmodiophora brassicae در B. oleracea شناسایی شده و به مارکرهای RFLP و AFLP پیوسته بوده اند. مشابها، مارکرهای 14a در LG1، مارکر 48 در LG4 و مارکر 177b در LG9 با ژن مقاومت به تورم ریشه Plasmodiophora brassicae (نژاد 7) در B. oleracea پیوسته بوده اند.

آزمایشاتی برای تولید مارکرهایی برای اسیدهای چرب مانند اسید لینولئیک، اسید لینولنیک، اسید الئیک، اسید پالمتیک و اسید اروسیک انجام گرفته است. دو مارکرRAPD، K-011100 و 25a با غلظت اسید لینولئیک پیوسته اند. مارکرهای رپید پیوسته با اسیدهای الئیک، لینولئیک و لینولنیک در B. napus شناسایی شده اند. مارکر رپید پیوسته با درصد اسید لینولنیک به یک مارکر همبارز SCAR تبدیل شده است. مارکرهای پیوسته با مناطق ژنومی کنترل کننده غلظت اسید لینولنیک در B. napus متناظر با ژن fad3 (omega-3-desaturase) در A. thaliana، یافت شده اند. در مطالعه ای دیگر، یک QTL منفرد حامل شش مارکر مرتبط با درصد اسید لینولئیک، پالمتیک و الئیک در B. rapa شناخته شده است. اخیرا دوQTL اصلی تاثیرگذار بر میزان اسید الئیک در B. juncea با استفاده از هر دو آنالیز فاکتور منفرد واریانس و نقشه یابی منقطع، نقشه یابی شده اند. لوکوس های اسید اروسیک با مارکرهای مولکولی بواسطه استفاده از آنالیز RFLP یا BSA در B. napus پیوسته بوده اند. در هر دو تحقیق، دو QTL شناسایی شدند. این QTL ها در LG 6 و LG12 یا در LG7و LG15 جای گرفته اند. در یک مطالعه مستقل، دو QTL مرتبط با میزان اسید اروسیک در B. napus شناخته شده و در دو لوکوس متفاوت، E1 و E2 ، نقشه یابی شدند. QTL های E1 و E2 متناظر با دو آلل b-ketoacyl-synthase (KCS) حاصل از B. campestris و B. oleracea ، دو گونه والدی B. napus بوده وپروتئین طویل ساز اسید چرب یک (Fae1) را کد می کنند. در B. rapa لوکوس های اسید اروسیک با مارکرهای RFLP پیوسته بودند.

ژن رنگ پوسته بذر با مارکرهای متنوع RFLP و RAPD برچسب گذاری شده است. مارکرهای RFLP پیوسته با رنگ پوسته بذر در B. napusبا استفاده از روش آنالیز افتراقی بالک (BSA) شناسایی شده اند. صفت رنگ پوسته بذر در B. campestris با مارکرهای رپید با استفاده از لاینهای اضافی B. campestris-oleracea برچسب گذاری شد.  نسبت سه به یک تفرق رنگ قهوه ای دانه به زرد در B. rapa بیانگر کنترل تک ژنی این صفت بوده ودر LG5 نقشه یابی شد. مطالعه تفرق صفت در جمعیت F2گونه B. juncea بیانگر افزایش عملکرد ژن غالب به نسبت فنوتیپی 15 به یک بود. دو مارکر RFLP در برگیرنده یک لوکوس شناخته شده اند. در یک گزارش جدید، صفت رنگ پوسته بذر با استفاده از یک روش ترکیبی BSA و AFLP در B. juncea برچسب گذاری شده است.

4- سویا

انجام نقشه یابی مولکولی و گزینش به کمک مارکر برای بهبود صفات کمی و کیفی گیاهان زراعی  (بخش اول)

مقدمه 

اگرچه، گیاهان زراعی در ابتدا بواسطه نتایج جستجوی غیرهدفمند انسان (برای منابع مناسب غذا) رو به تکامل نهادند امروزه این امر بیشتر از طریق برنامه های اصلاحی مدبرانه حاصل می شود. در حالیکه تغییرات در فعالیتهای زراعی و مکانیزاسیون کشاورزی، تاثیر چشمگیری بر بهره وری زراعی داشته اند، بهبود عملکرد اغلب گیاهان به سبب بهبود ژنتیکی آنها بوده است. علیرغم پیشرفتهای حاصله، بهبود بیشتر عملکرد و کیفیت محصولات، به سبب رشد جمعیت، افزایش قیمت نهاده هایی چون آب، کود و انرژی و ملاحظات مربوط به اثرات کودها و سموم شیمیایی بر زیست بوم و تغییر سریع سلایق مصرف کنندگان، مورد درخواست مستمر قرار دارد.     

اصلاح نباتات، بعنوان فرآیند مورد استفاده در طی قرنها، به میزان زیادی به گزینش صفات مطلوب بستگی دارد. این گزینشها اغلب شامل چرخه های متعدد اصلاحی بمنظور انتقال خصوصیات مطلوب زراعی و کیفی از والدین متفاوت به یک ژنوتیپ منفرد می باشند. پیشرفتهای جدید در بیوتکنولوژی منجر به توسعه ابزارهای بدیعی که نوید بخش اصلاح نباتات سریعتر و دقیق تر می باشند شده است. در این میان، مارکرهای مولکولی نوید بخش ترین ابزارها هستند. مارکرهای مولکولی قطعاتی از DNA گیاه هستند که اصلاحگران برای تشخیص حضور و یا عدم حضور آللهای مورد علاقه در گیاهان مورد آزمایش بکار می برند و بنابراین از آنها بعنوان ابزارهای گزینش بهره می برند. گزینش گیاهان مطلوب برپایه مارکرهای متصله را در اصطلاح گزینش به کمک مارکر(MAS) نامند. با استفاده از مارکرهای مولکولی، اصلاحگران می توانند روشهای گزینش برپایه فنوتیپ، که شامل گیاهان در حال رشد تا گیاهان بالغ است، را کوتاهتر ساخته و خصوصیات فیزیکی آنها را بمنظور آگاهی از ساختار بنیادین ژنتیکی آنها مورد بررسی دقیق قرار دهند. سیستمهای مارکرهای مولکولی مختلف توسعه یافته و برای استفاده تکامل یافته اند.

انواع مارکرهای مولکولی

1-RFLP

پلی مرفیسم های طولی قطعات برشی (RFLP)، با استفاده از آنزیمهای برشی که مولکولهای DNA ژنومی را در توالی های نوکلوتیدی خاصی (محل های برش) برش داده و بنابراین قطعات DNA با اندازه های مختلف را بوجود می آورند، شناسایی می شوند. شناسایی قطعات DNA ژنومی بوسیله ساترن بلات انجام می شود، فرآیندی که بموجب آن قطعات DNA جدا شده بوسیله الکتروفورز، به فیلتر نایلونی یا نیتروسلولز منتقل می شوند. سپس، DNA غیر متحرک در فیلتر اجازه می یابد تا با DNA پروب رادیواکتیویته هیبرید شود.  RFLPیک مارکر همبارز است که پروبها معمولا قطعات DNA کلون شده کوچک (بعنوان مثال cDNAو یا DNA ژنومی) هستند. فیلتر در مقابل فیلم عکاسی قرار می گیرد. جایی که تابش ماده رادیو ایزوتوپ از پروب، سبب تولید باندهای مرئی می شود.

2-RAPD